具有RNA-SEQ示例的共同工作流程

用户!2014
作者：马丁摩根（mtmorgan@fhcrc.org.），Sonali Arora
日期：2014年6月30日

概述

rnaseq.

• 计数-重叠对齐
• 已知基因
• 已知的抄本
• （新的转录物）

Chipseq - 染色质免疫尺寸

• (峰值)
• 峰值标识
• 差异绑定
• 主题和其他下游分析

变体

• （打电话）
• 注释
• 效果预测
• 格干
• 集成

结构的

• 副本号码
• 重新排列
• ......

深度：rnaseq

工作流程

• 实验设计
  • 复制
  • 批量效果
• 测序和对准
• 微分表达式
  • 数数
  • 统计评估
• 注释和下游分析

统计挑战

• 设计实验
• 图书馆大小正常化
• 计数（vs. rpkm）
  • 负二项分分布
  • 分散
• 借阅资料-收缩
• 独立过滤

甲状旁腺腺瘤中的rnaseq

这项工作流出来自更全面的示例甲状旁腺包装和套餐CSAMA 2014.作坊。它用deseq2.估计基因级差异表达。分析在计数读取与Ensembl基因区域对齐后拾取;计数可以使用SummarizeOverlaps（），如下所述甲状旁腺小插图。

数据来自Haglund等人《甲状旁腺腺瘤中功能性雌激素受体的证据》，《临床内分泌杂志》，2012年9月。本实验研究了雌激素受体在甲状旁腺肿瘤中的作用。研究人员从4例患者中提取甲状旁腺腺瘤细胞进行原代培养。这些原代培养物用二芳基丙腈(DPN)，一种雌激素受体β激动剂，或4-羟他莫西芬(OHT)处理。从处理和对照培养物中分别于24小时和48小时提取RNA。

首先加载计数数据，它已经被小心地作为概括分析目的。使用诸如此类的访问器探索对象Rowdata（SE）那冷酷（SE）那exptdata（se）$ miame， 和头（测定（SE））

要求（“deseq2”）

##加载所需包：DESEQ2 ##加载所需包：RCPP ##加载所需包：RCPParmadillo

需要（“甲状旁腺”）

##加载所需包：甲状旁腺

数据（“甲脱石甲状腺”）SE < - 甲状旁腺功能克拉姆斯（SE）< -  SE $ run

第一步是添加实验设计并执行额外的准备步骤。该实验包含几种技术复制，而这些技术可以在模型中纳入其中，这里我们只是汇集它们（汇集技术复制通常适用于RNAseQ数据）。

DDSFULL < -  DESQDATASET（SE，DESIGN =〜患者+处理）DDSCOLLAPSED < - 折叠事实（DDSFULL，GROUPBY = DDSFULL $ SAMPLE，RUN = DDSFULL $ RUN）DDS < -  DDSCOLLAPSED [，DDSCOLLAPSED $ TIME ==“48H”] DDS $时间< -  DROPLEVELS（DDS $ TIME）DDS $治疗<-ferfel（DDS $待遇，“控制”）

整个工作流程由呼叫执行Deseq（）功能。这包括库尺寸因子估计，色散估计，模型拟合，独立滤波和基于指定设计的测试统计数据。在这里，我们在DPN和控制之间进行比较生成结果。

DDS < -  DESQ（DDS）

##估计尺寸因子##估计离散度##基因离散度估计##均值-离散关系##最终离散度估计##拟合模型和检验

RES < - 结果（DDS，对比度= C（“处理”，“DPN”，“Control”）））

其余步骤提供了数据的一些基本检查和可视化。我们识别调整后的基因（多重比较）P.值小于0.1，并通过它们的log2折叠更改顺序。

Ressig < -  Res [哪个（Res $ Padj <0.1），]头（Ressig [Order（Ressig $ log2foldchange），]）

## log2折叠更改（地图）：治疗DPN VS Control ## Wald测试P值：治疗DPN VS Control ## DataFrame与6行和6列## Basemean Log2foldchange LFCSE STAT ##   <数字>   ## ESG00000163631 233.3 -0.9307 0.2842-03 ## ENSG000001980 0.151.6 -0.6902 0.151.6 -0.6902 0.151.0-05111111/01890-051111530.9 -0.6756 0.2109 -3.203 1.359E-03 ## ENSG00000233705 198.6 -0.6727 0.1446-4.651 3.398.6 -2351 3.3918-06 ## 401C-06 -651 0.1446-06 ## 4.9912-0.654 0.1212-06 ## 0.1212-0.654 0.1912-0.654 0.1046 -6254 3.9912-10 ## 3.9912-10 ## 3.  ## ENSG00000163631 5.685e-02 ## ENSG00000119946 2.448E-03 ## ENSG00000041982 1.986C-02＃6.687E-02＃6.687E-02＃6.687E-02＃6.687E-02 ## ESG0000000233705 1.053E-03 ## ensg000000911377 9.228e-07

“MA”曲线表示每个基因作为一个点，在X轴上的所有样品上具有平均表达，并且在Y轴上的处理组之间的LOG2折叠变化;突出显示的值是调整的基因P.值小于0.1。

plotma（res，ylim = c（-1,1））

采取的策略deseq2.对于分散估计总结了plotdispests（）功能。它显示（a）黑色每基因色散估计，（b）一个红色趋势线，代表色散和标准化计数之间的全局关系，©蓝色的“缩小”值通过全局关系培养各个色散估计，（d）蓝色 -具有未调整的高基因分散体的带圈分散异常值。

Plotdispests（DDS，Ylim = C（1E-6，1E1））

最终诊断是直方图的图P.值在零假设下应该是均匀的值;右边的歪斜可能表示在模型中不适合的批处理或其他效果

hist（res $ pvalue，breaks = 40，col =“灰色”）