作者:Martin Morgan (mtmorgan@fredhutch.org.）
日期:2015年9月7日
回车间大纲

这份文件中的材料要求R.版本3.2和Bioconductor版本3.1.

stopifnot（getRversion（）> ='3.2'&& getRversion（）<'3.3'，Biocinstaller :: Biocversion（）> =“3.1”）

差异表达的统计分析deseq2.

1. 实验设计
2. 湿式实验室制备
3. 高吞吐量排序
4. 结盟
   • 全基因组或转录组
5. 总结
   • Count读取重叠的感兴趣区域:GenomicAlignments: summarizeOverlaps ()
6. 统计分析
   • deseq2.那刨边机
7. 理解

更广泛的材料

• 刨边机和林马小插曲。
• deseq2.小插图。
• 气道Vignette用于对齐和摘要阶段。
• RNA-SEQ工作流程提供对气道数据集的更扩展分析。

挑战和解决方案

起点

• 矩阵的算读取每个感兴趣区域的读取
• 计数提供统计信息 - 更大的计数表明观察到读取的更大的信心。标准化措施（例如，RPKM）忽略此信息，因此失去统计权力。

正常化

• 纯粹技术原因对每个样本的读数差异
• 简单的按总读计数进行缩放不足-导致低读计数相关性
• 一般解决方案:规模由一个更稳健的尺度，如对数几何平均值，分位数，…

错误模型

• 从基因组中取样的读取耳的噪音。例如，与具有相同表达相同的短基因相比，较长的基因接受更多对齐的读数。
• 由于基因和个体之间的差异而产生的额外的生物变异
• 常见的建模假设：负二级方差
  • 色散参数

有限的样本大小

• 每次处理都有少量样本
• 成千上万的统计测试
• 挑战 - 有限的统计权力
• 解决方案 - 借用信息
  • 估计差异作为加权平均值每个基因方差和平均方差所有的基因
  • 每个基因的变异是精确估计的，尽管有一些准确性的损失
  • 举例适度检验统计量

多个测试

• 需要调整多重比较
• 减少测试数量可以增强统计能力

• 过滤基因以排除测试使用先天的标准

  • 没有生物学上有趣
  • 没有统计学上有趣的在零，例如，样品中不足的计数

工作流程

数据表示

三种信息类型

• 一种矩阵阅读的数量重叠感兴趣的区域
• 一种data.frame.概述分析中使用的样品
• Genomicranges.描述感兴趣的区域

SummarizedExperiment协调此信息

• 三种数据资源的协同管理
• 易于与其他软件集成Bioconductor软件

图书馆（“气道”）数据（气道）气道

## assays(1): counts ## rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005…LRG_98 LRG_99 ## rowRanges metadata column names(0): ## colnames(8): SRR1039508 SRR1039509…SRR1039520 SRR1039521 ## colData names(9): SampleName cell…样本BioSample

实验头主要成分(测定(气道))

# # SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520 # # ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047 770 # # ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0 0 # # ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799 417 # # ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331 233 55 # # ENSG00000000460 60 40 35 78 63 76 # # ENSG00000000938 0 0 2 0 1 0 0 # # SRR1039521 # #Ensg00000000003 572 ## ensg00000000005 0 ## ensg00000000419 508 ## ensg00000000457 229 ## ensg00000000460 60 ## ensg00000000938 0

colData(气管)

## Dataframe带8行和9列## Samplename Cell Dex Albut Run Avglength实验样本## <因子> <因子> <因子> <因子> <因子> <整数> <因子> <因子> ## SRR1039508 GSM1275862 N61311untrt untrt SRR1039508 126 SRX384345 SRS508568 ## SRR1039509 GSM1275863 N61311 TRT untrt SRR1039509 126 SRX384346 SRS508567 ## SRR1039512 GSM1275866 N052611 untrt untrt SRR1039512 126 SRX384349 SRS508571 ## SRR1039513 GSM1275867 N052611 TRT untrt SRR1039513 87 SRX384350 SRS508572 ## SRR1039516 GSM1275870 N080611 untrt untrt SRR1039516 120 SRX384353 SRS508575## SRR1039517 GSM1275871 N080611 TRT untrt SRR1039517 126 SRX384354 SRS508576 ## SRR1039520 GSM1275874 N061011 untrt untrt SRR1039520 101 SRX384357 SRS508579 ## SRR1039521 GSM1275875 N061011 TRT untrt SRR1039521 98 SRX384358 SRS508580 ##生物样品## <因数> ## SRR1039508 SAMN02422669 ## SRR1039509 SAMN02422675＃#srr1039512 samn02422678 ## SRR1039513 SAMN02422670 ## SRR1039516 SAMN02422682 ## SRR1039517 SAMN02422673 ## SRR1039520 SAMN02422683 ## SRR1039521 SAMN02422677

Rowranges（航空公司）

## GRANGESLIST长度为64102：## $ ENSG00000000003 ## GRANGES对象具有17范范围和2个元数据列：## SEQNAMES范围股票|EXON_ID EXON_NAME ##    |<整数>  ## [1] x [99883667,99884983]  -  |667145 ENSE001459322 ## [2] X [99885756,99885863]  -  |667146 ENSE00000868868 ## [3] X [99887482,99887565]  -  |667147 ENSE00000401072 ## [4] X [99887538,99887565]  -  |667148 ENSE00001849132 ## [5] x [99888402,99888536]  -  |667149 ENSE00003554016 ## ... ... ... ... ## [13] x [99890555,99890743]  -  |667156 ENSE00003512331 ## [14] X [99891188,99891686]  -  |667158 ENSE00001886883 ## [15] x [99891605,99891803]  -  | 667159 ENSE00001855382 ## [16] X [99891790, 99892101] - | 667160 ENSE00001863395 ## [17] X [99894942, 99894988] - | 667161 ENSE00001828996 ## ## ... ## <64101 more elements> ## ------- ## seqinfo: 722 sequences (1 circular) from an unspecified genome

##例如，协调子集包括dex 'trt'样本气道[，气道$dex == "trt"]

##类：范围ummarizedexperiment ## Dim：64102 4 ##元数据（1）：''##测定（1）：Counts ## Rownames（64102）：ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99 ## ROWRANGES元数据列名称（0）：## Colnames（4）：SRR1039509 SRR1039513 SRR1039517 SRR1039517 SRR1039521 ## COLDATA名称（9）：SAMPLENAME CELL ...样品生物素

##例如，只保留非零计数的行气道<-气道[rowsum (assay(气道))!= 0，]

DESeq2工作流程

1. 将实验设计信息添加到SummarizedExperiment

   图书馆（DESEQ2）DDS < -  DESEQDATASET（呼吸道，设计=〜CELL + DEX）

2. 执行基本的工作流程步骤

   DDS < -  DESQ（DDS）

   估计尺寸因子估计离散度估计基因离散度估计平均-离散度关系估计最终离散度估计拟合模型和测试

   dds

   ##类：DESQDATASET ## DIM：33469 8 ##元数据（1）：''##测定（3）：MU COOKS ## ROWNAMES（33469）：ENSG00000000419 ... ENSG00000000419 ... ENSG00000273493 ## ROWRANGES元数据列名称（46）：底座Basevar ......偏差Maxcooks ## Colnames（8）：SRR1039508 SRR1039509 ... SRR1039520 SRR1039520 SRR1039521 ## COLDATA名称（10）：SAMPLENAME CELL ... BIOSAMPLE SOUDITFACTOR

3. 提取结果

   RES < - 结果（DDS）RES

   ## log2 fold change (MAP): dex untrt vs trt #### baseemean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj ## <数字> <数字> <数字> <数字> <数字> <数字> ## ENSG00000000003 708.6021697 0.37424998 0.09873107 3.7906000 0.0001502838 0.001287304 ## ENSG00000000419 520.2979006 0.20215550 0.10929899 -1.8495642 0.0643763883 0.197080529## ENSG00000000457 237.1630368 -0.03624826 0.13684258 -0.2648902 0.7910940570 0.914355830 ## ENSG00000000460 57.9326331 0.08523370 0.24654400 0.3457140 0.7295576915 0.883713089 ## ENSG00000000938 0.3180984 0.11555962 0.14630523 0.7898530 0.4296136448 NA ## ... ... ... ... ... ... ... ## ENSG00000273487 8.1632350 -0.56331132 0.3736236 -1.5076976 0.1316319 0.3293588 ## ENSG00000273488 8.5844790 -0.10805538 0.3684853 -0.2932420 0.7693372 0.9032832 ## ENSG00000273489 0.2758994 -0.11282164 0.1424265 -0.7921393 0.4282794 NA ## ENSG00000273492 0.1059784 0.07644378 0.1248627 0.6122225 0.5403906 NA ## ENSG00000273493 0.1061417 0.07628747 0.1250713 0.6099516 0.5418939 NA