参考文献

朱丽娟,Lawrence M, Gupta A, Pages H, Kucukural A, Garber M, Wolfe SA(2017)。GUIDEseq:用于分析CRISPR-Cas核酸酶的GUIDE-Seq数据集的生物导体包。BMC基因组学,18(1)。http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3746-y

文章正文:用例

附加文件1:生成对齐和umi文件作为GUIDEseq输入的预处理步骤

附加文件2:GUIDEseq的安装和使用(适用于R和Bioconductor的新用户)

首先加载GUIDEseq和注释包。

我们将使用由人类样本生成的数据集,该数据集包含在GUIDEseq包中。为了标注靶标和脱靶,我们需要加载Human BSgenome包、Human Transcript和基因标识符映射包。

注意:在GUIDEseq中使用相同版本的基因组进行序列定位(预处理)和序列分析是至关重要的。

库(CRISPRseekGUIDEseqBioc2017Workshop)库(GUIDEseq)
# #
## ##附加包:'GUIDEseq'
以下对象从'package:CRISPRseek'中屏蔽:## ## annotateOffTargets
库(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19)库(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)

下面是关于GUIDEseq包的命令,以及如何使用两个工作流函数对不同类型的CRISPR系统进行GUIDE-seq数据分析,并比较不同的实验。

help(combineOfftargets) browseVignettes("GUIDEseq")

例1。SpCas9 GUIDE-seq数据分析

虽然分析工作流函数GUIDEseqAnalysis有超过60个用于定制分析的参数,但这些参数中的大多数都是预先设置的,用于分析最常用的核酸酶SpCas9的GUIDE-seq数据。因此,在分析SpCas9数据时,只需要用户提供少量目标特定的输入。

有四个必需的输入。
1) gRNA。file用于指定包含一个或多个fasta格式的grna的文件;
2)对齐。文件,用于指定1-2个包含bam格式序列对齐的文件;
3) umi。文件,每次读取指定1-2个包含UMI的文件;
4) BSgenomeName,用于指定包含基因组序列的BSgenome对象
请注意,如果没有指定outputDir,结果将自动保存在一个根据指定的峰值调用/合并/过滤条件命名的文件夹中,例如,gRNAmin80window20step20distance40将是默认的outputDir,代码片段如下。

gRNA文件可以通过文本编辑器或vi创建。align文件和umi文件都是在预处理步骤中生成的。分析结果以“offTargetAnaysisOfPeaks.xls”的形式保存在指定的输出目录下。

umi。Inputfile <- c(system。system. file("extdata", "plusLibraryUMI.txt", package = "CRISPRseekGUIDEseqBioc2017Workshop"), system. file("extdata", "plusLibraryUMI.txt", package = "CRISPRseekGUIDEseqBioc2017Workshop")file("extdata", "minusLibraryUMI.txt", package = "CRISPRseekGUIDEseqBioc2017Workshop"))对齐。inputfile <- c(system.file("extdata","plusLibrary.sort. "bam", package = "CRISPRseekGUIDEseqBioc2017Workshop"), system.file("extdata","minusLibrary.sort. "bam", package = "CRISPRseekGUIDEseqBioc2017Workshop")) gRNA。file <- system.file("extdata","gRNA. file "), package = "GUIDEseq") guideSeqRes <- GUIDEseqAnalysis(对齐。Inputfile =对齐。inputfile umi。Inputfile = umi。inputfile gRNA。file = gRNA。, orderOfftargetsBy = "peak_score",下行= TRUE, BSgenomeName = Hsapiens, min.reads = 80, n.cores.max = 4)
##删除重复读取…
##高峰呼叫…
##计算覆盖正链…
##计算负链覆盖率…
##呼叫高峰…
##寻找染色体的局部最大值:chr13
##计算覆盖正链…
##计算负链覆盖率…
##呼叫高峰…
##寻找染色体的局部最大值:chr13
##计算覆盖正链…
##计算负链覆盖率…
##呼叫高峰…
##寻找染色体的局部最大值:chr13
##结合正负峰…
保持峰值不合并。Gr存在于峰s1和峰s2中
##在两个库中找到带有读表示的未合并峰值
##脱靶分析…
##查找输入文件的grna“得分…”## >>>找到所有命中序列chr13+:27629413:27629420:chr13-:27629400:27629404…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13+:39262927:39262939:chr13-:39262918:39262920…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13+:88900985:88901002:chr13-:88900981:88901000…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13+:30964712:30964730…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+: 6668718:66687225…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+: 67161980:67161923…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:79233416:79233436…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:96233915:96233932…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:98226906:98226924…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:109316130:109316144…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:29087136:29087137…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:41110384:41110391…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>查找所有命中序列chr13-:97395652:97395666…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:115084360:115084375…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
##在序列2中完成偏离目标搜索##在序列1中完成偏离目标搜索##完成特征向量构建##完成得分计算##[1]“完成!”
if (!is.na(TS2)){中的警告:条件的长度为> 1,并且只有##第一个元素将被使用
##完成脱靶搜索!添加基因和外显子信息到offTargets ....##提取PAM序列和n.PAM.mismatch。
请检查gRNAmin80window20step20distance40目录下的输出文件
guideSeqRes offTargets美元
## offTarget peak_score predicted_cleavage_score ## 1 chr13:+:39262912:39262934 1894 1.2 ## 2 chr13:-:27629404:27629426 1380 3.2 ## 3 chr13:-:88900986:88901008 198 1.6 ## gRNA.name gRNAPlusPAM offTarget_sequence ## 1 HEK239_site4 ggcactgcggctggagaggtagaggtggtgtgg ## 2 HEK239_site4 ggcactgcggctggagaggtggggcactggttggggggggggtcggggcactggggggggggggggggggggggggggtagggggtgggg ## 3 HEK239_site4 ggcactgcggctggagaggtgggg# # guideAlignment2OffTarget offTargetStrand失配。distance2PAM ## 1 A…G.......A.......+ 20,16,8 ## 2 ....... g . t .........- 13,10 ## 3 ca ...... a ...........- 20,19,12 ## n.PAM.错配n.guide.错配PAM。序列offTarget_Start ## 10 3 TGG 39262912 ## 2 0 2 GGG 27629404 ## 3 0 3 TGG 88900986 ## offTarget_End染色体## 1 39262934 chr13 ## 2 27629426 chr13 ## 3 88901008 chr13

请注意,GUIDEseq包中包含对齐文件、umi文件和gRNA文件。要对您自己的数据进行分析,请指定目标序列(gRNA.file)、序列对齐(alignment.inputfile)和UMI输入文件(UMI .inputfile)的文件路径。下面的代码假设输入文件位于~/GUIDEseqSpCas9Input目录中。
offTargetsInPeakRegions.xls的分析结果将保存在outputDir指定的~/guideSeqResults目录中。

图书馆(GUIDEseq) gRNA。~/GUIDEseqSpCas9Input/SpCas9gRNAexample. file <- "~/GUIDEseqSpCas9Input/SpCas9gRNAexample. "足总”对齐。inputfile <- c("~/GUIDEseqSpCas9Input/plusLibrary.sort. "~/GUIDEseqSpCas9Input/minusLibrary.sort.bam")inputfile <- c("~/GUIDEseqSpCas9Input/plusLibraryUMI.txt", "~/GUIDEseqSpCas9Input/minusLibraryUMI.txt") outputDir <- "~/guideSeqResults" guideSeqResults <- GUIDEseqAnalysis(alignment. txt)Inputfile =对齐。inputfile umi。Inputfile = umi。inputfile gRNA。file = gRNA。file, BSgenomeName = Hsapiens, outputDir = outputDir)

默认情况下,预测解理评分采用张实验室的权重矩阵和评分算法。若要使用Root实验室开发的算法,请设置评分。method = " CFDscore "。

例2:标注off-targets

通过将参数txdb和orgAnn分别设置为特定于生物体的转录对象和基因ID映射对象,脱靶位点被注释,以指示脱靶位点是否与基因体重叠,以及它们是否位于外显子内。下面是SpCas9 GUIDE-seq数据处理的一个例子,它用人类基因组的特征注释了已识别的潜在脱靶位点。

库(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)库(org.Hs.eg.db) outputDir <- "~/guideSeqResults" guideSeqResults <- GUIDEseqAnalysis(align . hsapiens . ucsc .hg19. knowngene)Inputfile =对齐。inputfile umi。Inputfile = umi。inputfile gRNA。file = gRNA。BSgenomeName = Hsapiens, txdb = txdb .Hsapiens. ucsc .hg19。knownGene, orgAnn = org.Hs。egSYMBOL, outputDir = outputDir)
##删除重复读取…
##高峰呼叫…
##计算覆盖正链…
##计算负链覆盖率…
##呼叫高峰…
##寻找染色体的局部最大值:chr13
##计算覆盖正链…
##计算负链覆盖率…
##呼叫高峰…
##寻找染色体的局部最大值:chr13
##计算覆盖正链…
##计算负链覆盖率…
##呼叫高峰…
##寻找染色体的局部最大值:chr13
##结合正负峰…
保持峰值不合并。Gr存在于峰s1和峰s2中
##在两个库中找到带有读表示的未合并峰值
##脱靶分析…
##查找输入文件的grna“得分…”## >>>找到所有命中序列chr13+:27629413:27629420:chr13-:27629400:27629404…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13+:39262927:39262939:chr13-:39262918:39262920…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13+:41969948:41969968:chr13-:41969948:41969967…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13+:88900985:88901002:chr13-:88900981:88901000…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13+:19451019:19451039…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:19774713:19774728…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:20683165:20683185…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:20865113:20865133…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:20979028:20979048…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:21395595:21395615…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:21433912:21433925…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:21531840:21531856…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:21537218:21537233…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:21597770:21597790…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:21955661:21955681…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:22332147:22332167…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:22603877:22603897…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:22911530:22911550…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:23002153:23002173…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:23280771:23280783…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:23799953:23799973…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:24060919:24060939…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:24065254:24065274…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:24493823:24493843…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:24656963:24656976…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:24813832:24813841…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:24977283:24977303…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:24994998:24995012…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:25270857:25270860…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:25401847:25401850…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:25658368:25658388…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:25709772:25709792…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:26444955:26444975…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:26664550:26664570…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:26697477:26697485…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:26711781:26711797…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:27307572:27307592…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:27321560:27321580…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:27622701:27622721…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:27819707:27819721…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:27933064:27933084…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28034322:28034336…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28089775:28089795…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28176176:28176196…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28356573:28356593…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28461017:28461032…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28624328:28624348…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28629852:28629872…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28698872:28698891…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:28828738:28828758…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13+:29057568:29057588…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
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## >>>找到所有命中序列chr13+:101276598:101276606…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13+:101497256:101497267…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13+:101498260:101498280…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13+:102176734:102176753…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13+:102270775:102270795…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:105657854:105657874…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:105663003:105663023…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:105870541:105870561…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:105920990:105921003…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:106166366:106166386…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:106452923:106452943…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:106647621:106647641…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:106705673:106705693…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:106729799:106729812…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:106733920:106733940…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:106756775:106756792…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:107139762:107139782…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:107157855:107157875…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:107263769:107263789…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:107510504:107510524…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>查找所有命中序列chr13-:107579140:107579160…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:107629838:107629858…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:107680309:107680329…## >>>完成搜索
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找到所有命中序列chr13-:107996570:107996590…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:108023319:108023339…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:108239923:108239943…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:108594252:108594272…## >>>完成搜索## >>>查找所有命中序列chr13-:108921354:108921374…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:109017649:109017669…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:109196103:109196114…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:109224280:109224297…## >>>完成搜索
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## >>>查找所有命中序列chr13-:109385238:109385258…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:109396949:109396968…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:110037163:110037182…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:110242529:110242549…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:110360574:110360594…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:110415695:110415715…## >>>完成搜索
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## >>>找到所有命中序列chr13-:110503424:110503444…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:110707674:110707691…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:110988851:110988871…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111045631:111045651…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111087606:111087626…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111116962:111116982…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111122276:111122282…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111286012:111286032…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111358800:111358820…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111449261:111449278…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:111988846:111988866…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:112003836:112003855…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:112030230:112030250…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-: 11206282:112062822…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:112506074:112506094…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:112602235:112602252…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>查找所有命中序列chr13-:113059306:113059316…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:113191739:113191759…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:113406107:113406127…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:113459048:113459068…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:113777643:113777663…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:113813260:113813280…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:113817955:113817975…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:113911253:113911269…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:114050133:114050148…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:114056067:114056087…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:114093768:114093783…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:114170461:114170481…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:114184442:114184462…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:114246935:114246955…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:114967050:114967070…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
## >>>找到所有命中序列chr13-:115084360:115084375…## >>>完成搜索
##搜索命中的警告(gRNAs = gRNAs1, PAM = PAM, PAM。pattern = PAM。没有找到匹配,请检查您的输入序列,并确保您使用的是正确的基因组。你也可以改变你的##搜索条件,比如增加max.mismatch!
##在序列2中完成偏离目标搜索##在序列1中完成偏离目标搜索##完成特征向量构建##完成得分计算##[1]“完成!”
if (!is.na(TS2)){中的警告:条件的长度为> 1,并且只有##第一个元素将被使用
##完成脱靶搜索!添加基因和外显子信息到offTargets ....##提取PAM序列和n.PAM.mismatch。
##请检查~/guideSeqResults目录下的输出文件

要注释其他基因组中的off-target,请相应地设置txdb和orgAnn。例如,将“txdb”设置为“txdb . mmusculus . ucsc .mm10”。knownGene和orgAnno to org.Mm.eg.db for mouse。

例3。合并多个实验的脱靶,以方便在不同核酸酶构型或变体之间进行比较。

在评估新的核酸酶处理条件或不同的Cas9变体时,通常的做法是将标准平台的脱靶分析作为对照。为了帮助比较不同核酸酶,可以使用combineOfftargets函数轻松合并由GUIDE-seq识别的脱靶。下面是合并三个实验的示例代码,并生成一个维恩图来描述实验之间的脱靶重叠。

# # 1 # # offTarget predicted_cleavage_score gRNA.name chr10: +: 102729240:102729262 T2 # # 2 chr10: 0.8 +: 102821501:102821523 T2 # # 3 chr10: 0.2 +: 135149931:135149953 T2 # # 4 chr10: 0.8 +: 72538201:72538223 0.2 T2 # # 5 chr10:——:116294250:116294272 1.4 T2 # # 6 chr11: 0.0 +: 116811440:116811462 T2 # # gRNAPlusPAM offTarget_sequence guideAlignment2OffTarget # # 1 GACCCCCTCCACCCCGCCTCCGG CCCCCCCCCCGCCCCGCCTCCAG CC…C . . G……## 2 gaccccctccccccccccgg ctacccccactccccgcctccgg cta .... ca.t .........## 3加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加## 4 gaccccctccaccccgcctccgg cagtcccccccccccctctgg c.gt…c ....... a ....## 5 ccccccccccccccccccccccccccccccccccccccagg cc .. a .. c ............gacccccccccccccccccccctt c ...... g…gaccccc ....## offTargetStrand不匹配。distance2PAM n.PAM.mismatch n.guide.mismatch ## 1 + 20,19,13,10 1 4 ## 2 + 20,19,18,13,12,10 0 6 ## 3 + 20,19,15,13 0 4 ## 4 + 20,18,17,13,5 0 5 # 5 - 20,19,16,13 0 4 ## 6 + 20,13,9,7,5 2 5 ## PAM。序列offTarget_Start offTarget_End染色体## 1 CAG 102729240 102729262 chr10 ## 2 CGG 102821501 102821523 chr10 ## 3 CGG 135149931 135149953 chr10 ## 4 TGG 72538201 72538223 chr10 ## 5 AGG 116294250 116294272 chr10 ## 6 CTT 116811440 116811462 chr11 ##野生型SpCas9。peak_score SpCas9-MT3-ZFP。peak_score ## 1 7 NA ## 2 24 NA ## 3 19 NA ## 4 13 NA ## 5 25 NA ## 6 13 NA ## Split-SpCas9双NLS。peak_score # 1 8 ## 2 22 ## 3 29 ## 4 35 ## 5 13 ## 6 NA

请注意,以上代码假设每个都脱靶。文件夹中包含offTargetsInPeakRegions.xls文件

如果需要,combineOfftargets可以通过将remove.common设置为TRUE来删除不同grna之间常见的off-target。此外,如果有不含核酸酶的对照样品,可以通过设置control.sample.name从gRNA样品中去除对照样品中存在的峰。

练习1。NmCas9 GUIDE-seq数据分析

提示:与SpCas9相比,NmCas9具有更长的gRNA(24个核苷酸),以及不同的PAM序列偏好(NNNNGATT)

练习2。Cpf1 GUIDE-seq数据分析

提示:与SpCas9相比,Cpf1具有不同的PAM序列偏好(TTTN), TTTN位于原间隔层的5 '侧,而SpCas9或NmCas9则识别原间隔层3 '侧的NGG PAM。