1.1ChIP-seq

Lun,BioC 2015

哈尔琴科等人(2008)。

• 标签与测序读数;3'方向的单端读取扩展
• 股线移位/交叉相关
• 定义峰(狭窄的，如转录因子结合位点)相对于弥漫性峰(如组蛋白标记)

差分绑定芯片seq

• 设计实验，每次治疗重复样品
• 微阵列/ rna序列分析

新颖的统计问题

• 推断没有“数据窥探”的峰值（使用相同的数据两次，一次推断峰值，一次估计差分绑定）
• 保留权力
• 减少错误发现率

1.2工作流程

• 继贝利等人之后，2013

实验设计与执行

• 单样本

  • 芯片转录因子和
  • 输入(片段基因组DNA)或对照(例如，带有非特异性抗体如免疫球蛋白G, IgG的IP)

• 设计实验

  • TF / control对的复制

测序和比对

• 拇指测序深度规则：\ \(> 10米)阅读为狭窄的山峰，\（> 20m \）为广大的山峰
• 长期和配对的末端有用但不是必要的 - 在暧昧地区的对齐
• 基本对准器一般是适当的，例如，不需要对准拼接接头
• 西姆斯et al .,2014

峰值呼叫

• 大量的峰值调用程序;有些专门用于窄峰和宽峰。
• 少数用：苹果电脑、PeakSeq、CisGenome、…

• 基于模型的ChIP-Seq分析，Liu等，2008

  • 缩放控制标签计数，以匹配芯片计数
  • 中心峰值移位\（d / 2 \）
  • 将标签的出现建模为泊松过程
  • 寻找固定宽度的滑动窗口与多余数量的标签丰富
  • 经验FDR:交换芯片和控制样本;FDR是#控制峰值/ #芯片峰值
  • 输出:被调用峰值的BED文件

加分析

• 注释：我的山峰附近是什么基因？
• 差分表示：与治疗2相比，治疗1中的峰值过度或代表哪些峰值？
• 图案识别(超过已知图案的峰值?)和发现
• 综合分析，例如，调控元件的关联和表达

1.3峰值呼叫

“已知”范围

• 计数预定义范围内的标签，例如已知基因的启动子区域
• 明显的限制，例如，监管要素不在指定范围内;指定的范围包含具有互补行为的多个监管元素

新创窗户

• 宽度:窄峰，1bp;广泛的山峰,150个基点
• 偏移量:25 - 100 bp;影响的计算负担

新创峰值呼叫

• 第三方软件(许多可用;苹果电脑常用的)

• 呼叫峰值的各种策略 - LUN＆SMYTH，表1

  • 独立调用每个样本;样品间峰的相交或联合，…
  • 来自集合库的呼叫峰值
  • …

• 相关幻灯片pdf

1.4跨库的峰值调用

• 表1:峰值呼叫策略描述。每个策略都有一个标识符，并由MACS运行的模式、运行它的库以及合并库或组之间峰值的合并操作(如果有的话)来描述。对于方法6，在富集的每个方向上取峰并置。

ID	模式	图书馆	操作
1	单样本	个人	联盟
2	单样本	个人	十字路口
3.	单样本	个人	至少2
4	单样本	汇集在一起	联盟
5	单样本	汇集在一起	十字路口
6	两个示例	汇集在一起	联盟
7	单样本	汇集了所有	-

• 如何选择?- Lun & smith，

  • 在原假设下，第I类错误率是一致的

    ## 10万个t检验在null下，n = 6 n <- 6;m <- matrix(rnorm(n * 100000)， ncol=n) P <- genfilter::rowttests(m, factor(rep(1:2, each=3)))$ P。值分位数(P c(。001 . 01 . 05))

    ## 0.1% 1% 5% ## 0.000965875 0.010195115 0.049456354

    嘘(P,减免= 20)

    

  • 表2:第一类错误的结果
  • 最佳策略:从集合库调用峰值

  • 表2:使用来自每个峰值调用策略的计数测试差异富集时观察到的类型I错误率。显示了指定错误阈值范围的错误率。所有值代表10次模拟迭代的平均值，标准误差在括号中显示。参考分析:使用10000个随机选择的真峰。

ID	出错率
	0.01	0.05	0.1
类风湿性关节炎	0.010（0.000）	0.051（0.001）	0.100 (0.002)
1	0.002（0.000）	0.019 (0.001)	0.053 (0.001)
2	0.003 (0.000)	0.030 (0.000)	0.073 (0.001)
3.	0.006 (0.000)	0.042 (0.001)	0.092 (0.001)
4	0.033 (0.001)	0.145 (0.001)	0.261（0.002）
5	0.000 (0.000)	0.001（0.000）	0.005 (0.000)
6	0.088 (0.006)	0.528（0.013）	0.893（0.006）
7	0.010（0.000）	0.049 (0.001)	0.098 (0.001)

3.11 - 4:实验设计…对齐

该实验涉及胚胎干细胞和末端神经元之间NFYA蛋白结合谱的改变。它是Tiwari等人提供的数据的子集。2012可作为GSE25532。有两个es(胚胎干细胞)和两个tn(末端神经元)复制。从GEO中提取单端FASTQ文件，使用rsubread.，并处理后（分类和索引）使用Rsamtools这个脚本:

# # SystemRequirements: ascp;fastq-dump source(“setup.R”)library(SRAdb) library(Rsubread) library(Rsamtools) library(BiocParallel) SRAdb <-“SRAmetadb. r”Sqlite " key <- "/app/aspera-connect/3.1.1/etc/asperaweb_id_dsa。openssh“cmd = sprintf(“ascp tt -l300m我% s”,键)源(“setup.R”)如果(! file.exists (sradb)) getSRAdbFile () = dbConnect监狱(dbDriver(“SQLite”),sradb) accs < - rownames(文件)[! file.exists(文件$ sra)]对accs (acc) sraFiles = ascpSRA (acc,案子,cmd文件类型=“sra destDir = getwd ()) sra文件< - $ sra [! file.exists(文件fastq美元)]bplapply (sra,function(sra) system(sprintf("fastq-dump——gzip %s"， sra)) fastqs <- files$fastq[!file.exists(files$bam)] if (length(fastqs)) Rsubread::align("../mm10/mm10.Rsubread. ")<- files$bam[!file.exists(sprintf("%s. exists "， %s. exists("%s. exists "， %s. exists))bams_sorted <- sub(". bat "， files$bam))BAM”、“.sorted。<- bpmapply(sortBam, bams, bams_sorted) ##糟糕!并不是说要做下一行文件。rename(sorted, names(sorted)) bplapply(sorted, indexBam)

这将生成4个BAM文件，每个示例一个。每个BAM文件大约为2gb。这些文件被总结为以下数据帧:

files <- local({acc <- c(es_1="SRR074398"， es_2="SRR074399"， tn_1="SRR074417"， tn_2="SRR074418") data.frame(Treatment=sub("_.*"， ""， names(acc)))， replication =sub(". *"， ". name (acc) "));*_"， "， names(acc))， sra=sprintf("%s。Sra "， acc)， fastq=sprintf("% s.s fastq.gz"， acc)， bam=sprintf("% s.s fastq.gz.subread. zip "， bam=sprintf("% s.s fastq.gz.subread. zip "， acc)，， row.names=acc, stringsAsFactors=FALSE)})

3.25：减少

为了处理数据，我将切换到BAM文件所在的目录

setwd (~ / UseBioconductor-data / ChIPSeq / NFYA”)

然后在重叠窗口中加载csaw库和计数读取。

图书馆(csaw)图书馆(GenomicRanges)碎片弹。Len <- 110系统。time({data <- windowCounts(files$bam, width=10, ext= fraga .len)}) # 156 seconds acc <- sub(".fastq. txt ")cbind(files[acc，]， colData(data))

将此数据加载到您自己的数据中R使用以下命令进行会话:

数据< - readRDS(“csaw-data.Rds”)

数据是一个SummarizedExperiment，所以稍微探索一下……

3.36:分析

过滤从过滤低计数窗口开始。有可能有很多(多少?)是否有合理的方法选择过滤阈值?

library(edgeR) # for aveLogCPM() keep <- aveLogCPM(assay(data)) >= -1 data <- data[keep，]

标准化(成分偏差)(插图第4章)csaw在标准化中使用了binned计数。相对于ChIP峰值，bin较大，假设bin主要代表无差异的边界区域。使用edger.RNASeq差异表达实验室采用的TMM (M值的裁剪中值)方法。关于规范化的更多信息请参见第4章(在为其他协议开发规范化方法时，这是一个有用的资源!)

这需要访问大数据，所以我们不运行以下代码

系统。time({binned <- windowCounts(files$bam, bin=TRUE, width=10000)}) #139秒

而是把总结加载到我们的会话中

Normfacs < -  Readrds（“CSAW-NORMFACS.RDS”）

实验设计和差动绑定(插图第5章)差异装订将评估使用edger.，我们需要详细说明实验设计

< -设计模型。矩阵(~治疗,colData(数据)

适用的标准edger.识别差异边界区域的工作流程。创造性地探索结果。

y <- estimateDisp(y, design) fit <- glmQLFit(y, design, robust=TRUE) results <- glmQLFTest(fit, contrast=c(0,1)) head(results$table)

## logFC logCPM˚Fp值## 1 -0.6739731 -1.360819 0.6314884 0.43210089 ## 2 -0.7693277 -1.401691 0.7997943 0.37718999 ## 3 -0.3620229 -1.330818 0.1863866 0.66855710 ## 4 0.4943534 -1.373149 0.3463071 0.55994411 ## 5 1.4757585 -1.168808 3.1350061 0.08523217＃＃6 2.1921162 -1.241795 5.7634503 0.02174394

多个测试(小品第6章)挑战是FDR跨越所有检测到的差异界限地区是我们感兴趣的，但是我们马上就能得到的是FDR的差异界限窗户;区域通常由多个重叠的窗口组成。作为第一步，我们将采用一种“快速而肮脏”的方法，通过合并“高丰度”窗口来识别区域，例如，彼此之间有1kb

合并<-合并windows (rowRanges(data)， tol=1000L)

在区域内跨窗口组合测试结果。在小插图的第6.5节中探讨了几种策略。

tabcom <- combineTests(合并$id，结果$table)头(tabcom)

# # nWindows logFC。logFC。100 0.38981304 0.5705249 ## 52 00 0.19036362 0.3609546 ## 610 0 0.83202268 0.9134050

Vignette第6.6节讨论了识别区域内“最佳”窗口的方法。

最后,创建一个GRangesList与两个结果表和计算结果的基因组范围相关联。

gr <- rowRanges(data) mcols(gr) <- as(results$table， "DataFrame") grl <- split(gr, merged$id) mcols(grl) <- as(tabcom， "DataFrame")

4.1sessionInfo ()

sessionInfo ()

## R 3.2.2（2015-08-14）##平台：X86_64-PC-Linux-GNU（64位）##正在运行：debian gnu / linux stretting / sid ## ## locale：##[1] lc_ctype = en_us.utf-8 lc_numeric = c lc_time = en_us.utf-8 ## [4] lc_collat​​e = en_us.utf-8 lc_monetary = en_us.utf-8 lc_messages = en_us.utf-8 ## [7] lc_paper = en_us.utf-8 lc_name = c lc_address = c ## [10] lc_telephone = c lc_measurement = en_us.utf-8 lc_identified = c ## ##附加基本包：## [1] stats4并行统计图形grdevicesUtils数据集方法Base ## ##其他附加包：## [1] ClusterProfiler_2.3.8 ChipSeeeker_1.5.11 ##] Edger_3.11.5 CSAW_1.3.14 ## [5] GeneFilter_1.51.1 RColorBrewer_1.1-2 ## [7] gplots_2.17.0 Genomicfiles_1.5.8 ## [9] Biocparallel_1.3.54 homo.sapiens_1.3.1 ## [11] go.db_3.2.2 Organismdbi_1.11.43 ## [13] BioMart_2.25.3 AnnotationHub_2.1.45 ## [15]variantannotation_1.15.34 rnaseqdata.hnrnpc.bam.chr14_0.7.0 ## [17] genomicalignments_1.5.18 rsamtools_1.21.21 ## [19] all_1.11.0 org.hs.eg.db_3.2.3 ## [21] rsqlite_1。0.0 dbi_0.3.1 ## [23] ggplot2_1.0.1 airway_0.103.1 ## [25] limma_3.25.18 deseq2_1.9.51 ## [27] rcpparmadillo_0.6.100.0.0 rcpp_0.12.1 ## [29] bsgenome.hsapiens.ucc。hg19_1.4.0 bsgenome_1.37.6 ## [31] rtracklayer_1.29.28 txdb.hsapiens.ucsc.hg19.knowngene_3.2.2 ## [33] GenomicFeatures_1.21.33 AnnotationDbi_1.31.19 ## [35]概述_1.11 BioBase_2.29.1 ## [37] GenomicRanges_1.21.32 Genomeinfodb_1.5.16 ## [39] Microbenchmark_1.4-2 BioStrings_2.37.8 ## [41] XVector_0.9.4讽刺_2.3.26 ## [43] S4Vectors_0.7.23 Biocgenerics_0.15.11 ## [45] Biocstyle_1。7.9 ####通过命名空间加载（且未附加）：## [1] th.data_1.0-6 colorspace_1.2-6 qvalue_2.1.0 ## [4] futile.logger_1.4.1 topgo_2.21.0 InteractiveIsplayBase_1。7.3 ## [7] MVTNOMM_1.0-3 CODETOOLS_0.2-14拼接_3.2.2 ## [10] GOSEMSIM_1.27.4 GENEPLOTTER_1.47.0 KNITR_1.11 ## [13] formure_1.2-1 gridbase_0.4-7 Annotate_1。47.4 ## [16] cluster_2.0.3 png_0.1-7 graph_1.47.2 ## [19] shiny_0.12.2 httr_1.0.0 assertthat_0.1 ## [22]表单ATR_1.2.1 ACEPACK_1.3-3.3 HTMLTOOLS_0.2.6 ## [25] TOOLS_3.2.2 iGraph_1.0.1 GTABLE_0.1.2 ## [28] do.db_2.9 REHAPE2_1.4.1 DOLER_0.4.3 ## [31] GDATA_2.17.0 StringR_1.0.0 proto_0.3-10 ## [34] mime_0.4 gtools_3.5.0 statmod_1.4.21 ## [37] xml_3.98-1.3 dose_2.7.12 zlibbioc_1.15.0 ## [40] mass_7.3-44 zoo_1.7-12scales_0.3.0 ## [43] BiocInstaller_1.19.14 RBGL_1.45.1 sandwich_2.3-4 ## [46] SparseM_1.7 lambda.r_1.1.7 yaml_2.1.13 ## [49] gridExtra_2.0.0 UpSetR_0.0.5 rpart_4.1-10 ## [52] latticeExtra_0.6-26 stringi_0.5-5 plotrix_3.5-12 ## [55] caTools_1.17.1 boot_1.3-17 bitops_1.0-6 ## [58] evaluate_0.8 lattice_0.20-33 labeling_0.3 ## [61] plyr_1.8.3 magrittr_1.5 R6_2.1.1 ## [64] Hmisc_3.17-0 multcomp_1.4-1 foreign_0.8-66 ## [67] KEGGREST_1.9.1 survival_2.38-3 RCurl_1.95-4.7 ## [70] nnet_7.3-11 futile.options_1.0.0 KernSmooth_2.23-15 ## [73] rmarkdown_0.8.1 locfit_1.5-9.1 grid_3.2.2 ## [76] digest_0.6.8 xtable_1.7-4 httpuv_1.3.3 ## [79] munsell_0.4.2